影响琼脂糖凝胶电泳色谱仪电泳迁移率的因素有DNA分子大小、DNA构象、凝胶浓度、琼脂糖种类、电泳缓冲液、嵌入染料的存在和使用电压等。一、DNA分子大小:DNA分子大小迁移速度与logN成反比(N为碱基对数目)。分子越大,摩擦力越大,同时大分子通过凝胶孔的效率低于较小的分子,所以大分子的迁移速度慢。一般来说,分子带的电荷量越大,直径越小,形状越接近球形,迁移速度越快。二、DNA构象:等量的空间结构,紧密结构的迁移速度快,超螺旋环状DNA>线状DNA>单链开环DNA。三、凝胶浓度:凝胶浓度越大,分子孔径越小,DNA迁移速度越慢。反之,迁移速度越快。凝胶浓度也与凝胶的分辨率有关。凝胶浓度越大,分辨率越高,但分离的DNA片段越小。四、琼脂糖种类:包括标准琼脂糖、低熔点琼脂糖和正在研制的介于二者之间的琼脂糖,其分辨率各有不同。五、电泳缓冲液:缓冲液pH值距离其等电点越远,其所带净电荷量越大,迁移速度越快,尤其是蛋白质等两性分子。缓冲液pH值影响电泳方向。缓冲液的离子强度过低,电导率降低,DNA不是全然不动就是迁移极慢。离子强度过高,电导率上升,会产生大量热能,使凝胶发生变化甚至熔化,也会使DNA变性。六、嵌入染料的存在:染色剂溴化乙锭插入双链DNA会造成其负电荷减少,刚度和长度增加,因此,线性DNA-染料复合物在凝胶中的迁移速度降低约15%。七、使用电压:低电压时,线状DNA片段的迁移速度与所加电压成正比。凝胶上所加电压不应超过5~8V/cm。 来源:http://www.fudizao.com |