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酶免疫技术是以酶标记的抗体或抗原为主要试剂的方法，是标记免疫技术的一种。免疫技术是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即应用制备好的特异性抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。 一、酶免疫技术的分类 酶免疫技术是以酶标记的抗体或抗原为主要试剂的方法，是标记免疫技术的一种。免疫技术是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即应用制备好的特异性抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。它的特点是具有高度的特异性和敏感性。如将抗原或抗体用可以微量检测的标记物(例如放射性核素、荧光素、酶等)进行标记，则在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作用，进一步提高了免疫技术的敏感性。这种标记免疫技术一般分为两类，一类用于组织切片或其他标本中抗原或抗体的定位;另一类用于液体标本中抗原或抗体的测定。前者属于免疫组化技术(immunohistochemical telchnique)范畴，后者则称为免疫测定(immunoassay)。 酶免疫测定根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游离的酶标记物而分为均相(homogenous)和异相(heterogenous)两种类型，实际上所有的标记免疫测定均可分成这两类。以标记抗体检测标本中的抗原为例，按照简单的形式是在试剂抗体过量的情况下进行，其反应式如下： Ab*+ Ag——Ab*Ag+Ab* Ab*Ag代表结合的标记物， Ab*为游离的标记物。如在抗原反应后，先把Ab*Ag与Ab* 分离;然后测定Ab*Ag或Ab*中的标记物的量，从而推算出标本中的抗原量，这种方法称为异相法。如在抗原抗体反应后Ab*Ag中的标记物* 失去其特性，例如酶失去其活力，荧光物质不显荧光，则不需要进行Ab*Ag 与Ab*的分离，可以直接测定游离的Ab* 量，从而推算出标本中的Ag含量，这种方法称为均相法。 在异相法中，抗原和抗体如在液体中反应，分离游离和结合的标记物的方法有许多种。与放射免疫测定相类似的液相异相酶免疫技测定，在某些激素等定量测定中也有应用。但常用的酶免疫测定法为固相酶免疫测定。其特点是将抗原或抗体制成固相制剂，这样在与标本中抗体或抗原反应后，只需经过固相的洗涤，就可以达到抗原抗体复合物与其他物质的分离，大大简化了操作步骤。这种被称为EL1SA 的检测技术成为目前临床检验中应 用较广的免疫测定方法。 二、方法类型和操作步骤 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：① 固相的抗原或抗体，② 酶标记的抗原或抗体，③ 酶作用的底物，根据试剂的来源和标本的性状以及检测的条件，可设计出各种不 同类型的检测方法。 (一)双抗体夹心法： 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： (1)将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 (2)加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与同相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 (3)加酶标抗体：使同相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 (4)加底物：酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可双抗原夹心法测定标本中的抗体。 (二)双位点一步法： 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步法不但简化了操作， 缩短了反应时间，如果使用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。 在一步法测定中，应注意钩状效应(hook effect)，类同于沉淀反应中抗原过剩的后滞现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 (三)间接法测抗体 ： 间接法是检测抗体时最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗-抗体检测已与固相结合的受检抗体。故称为间接法。操作步骤如下： (1)将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。 (2)加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。 (3)加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如： 欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人lgG抗体。 (4)加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。 本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。 (四)竞争法 竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与同相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下： (1)将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。 (2)待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与同相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。 (3)加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深，参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表于标本中抗原含量越多。 (五)捕获法测lgM抗体 血清中针对某些抗原的特异性lgM常和特异性lgG伺时存在，后者会干扰lgM抗体的测定。因此测定lgM抗体多用捕获法。先将所有血清lgM(包括异性lgM和非特异性lgM)固定在固相上，在除去lgG后再测定特异性lgM。 操作步骤如下： (1)将抗人lgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人 lgM。洗涤。 (2)加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的lgM 抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。 (3)加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性lgM 结合。洗涤。 (4)加入针对特异性的酶标抗体，使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。 (5)加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性lgM抗体存在，为阳性反应。 (六)亲和素和生物素的ELlSA亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4 个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素(strepavidin)。生物素(biotin)又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素一羟基玻璃亚胺酯(biotin-hydroxysuccinimide，BNHS)可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大大提高检测的灵敏度。 亲和素——生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在同相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原生物素结合，通过亲和素——生物素反应而使生物素化的抗体或抗原固相化，这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素——酶结合物，以放大反应信号。 ELISA的试剂 在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物等。完整的ELISA试剂盒包含以下各组分： (1)已包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂); ELISA试剂 (2)酶标记的抗原或抗体(结合物); (3)酶的底物; (4)阴性对照品和阳性对照品(定性测定中)，参考标准品和控制血清(定量测定中); (5)酶联物(结合物)及标本的稀释液; (6)洗涤液; (7)酶反应终止液。 方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法: 1. 包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃ 过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。 2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。 3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小时，洗涤。 4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分钟。 5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。 |